全国服务统一热线
4006183565
版权归北京华鲁佳奥净化科技发展有限公司所有 中企动力提供技术支持 京ICP备11009822
资讯分类
NEWS
资讯详情
实时定量PCR实验室管理及污染预防
2019/06/12 08:53
浏览量
【摘要】：
PCR(聚合酶链式反应)检测技术广泛应用于临床和预防医学中，特别是针对病毒的检验，PCR反应的特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，微量的污染即可造成假阳性的产生。
为降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。应该从实验室区域划分做起。根据临床基因扩增检验实验室区域设置原则 ：基因扩增检验实验室 区域应包括①试剂储存和准备区，②标本制备区，③扩增反应混合物配制和扩增区，④扩增产物分析区。各工作区域须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。进入各工作区域严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。不同的工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。
工作区域仪器设备配置也有相应的标准。每个区域均需配置基本设置包括微量加样器(覆盖1-1000u1)，可移动紫外灯(近工作台面)，消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)，专用工作服和工作鞋，专用办公用品。另外各区还需配置如下实验用品。试剂储存和准备区：2～8℃和-15℃冰箱，混匀器；标本膜板制备区：2～8℃冰箱、-20或-80℃冰箱，高速台式冷冻离心机，混匀器，水浴箱或加热模块，超净工作台，如需处理大分子DNA，应具有超声波水浴仪，0.2mL和1.5mL的EP管。扩增反应混合物配制和扩增区：核酸扩增仪和实时定量核酸扩增仪；0.2mL的PCR反应管，96或384孔PCR反应板。扩增产物分析区，视检验方法不同而定。
工作区域按规定管理之后，还得要求操作人员进行PCR操作时严格遵守操作规程，以降低可能出现的PCR污染。
首先要做好污染的监测，以便采取措施，防止和消除污染。监测包括设立阳性对照，阴性对照，进行重复性试验，和选择不同区域的引物进行PCR扩增。
其中阳性对照应选择扩增度中等、重复性好的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量通常要求在100个拷贝以下。实验稳定后，可免设阳性对照。每次PCR实验务必做阴性对照。包括：①样本对照，仅加入样本，②试剂对照，仅加PCR试剂，不加模板。
分装试剂应注意：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装；引物，dNTP用高压的双蒸水配制；配制后应分装储存，标明时间，以备发生污染时查找原因。
PCR实验操作中，扩增序列的残留污染是假阳性的主要原因，样品间的交叉污染其次。因此，在进行扩增反应需谨慎，收集样品、抽提和扩增时也应注意：戴一次性手套，并及时更换；使用一次性吸头，及时丢弃，且不与PCR产物分析室的吸头混用；避免反应液飞溅，开盖前稍离心。若溅出，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装；尽可能用可替换或可高压处理的加样器，因为加样器容易受产物气溶胶或标本DNA的污染。加样器不交叉使用。
环境污染中常见的污染源主要有：经常用稀酸擦拭可能污染区域或对环境进行紫外照射，可有效预防PCR实验室环境污染。也可用擦拭实验来查找可疑污染源：用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；0.1mL去离子水浸泡；取5μL做PCR实验；电泳检测结果。污染还可能足由空气中含PCR产物的气溶胶造成的，因此，实验场所要保持通风良好。
关键词：
上一篇：
检验科实验室的合理布局
洁净实验室的保养
下一篇：
